Edición de bases mitocondriales in vivo a través de la entrega viral adenoasociada a tejido posmitótico de ratón
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28358-w

Las mitocondrias albergan procesos metabólicos clave vitales para el suministro de energía celular y son centrales a las decisiones del destino celular. Están sujetos a un control genético único tanto por el ADN nuclear como por su propio genoma de copias múltiples: ADN mitocondrial (ADNmt). Las mutaciones en el mtDNA a menudo conducen a enfermedades hereditarias maternas clínicamente heterogéneas que muestran una presentación específica de órgano diferente en cualquier etapa de la vida. Durante mucho tiempo, la manipulación genética de mamíferos mtDNA ha planteado un gran desafío, lo que impide nuestra capacidad para comprender la biología mitocondrial básica y los mecanismos que sustentan la enfermedad mitocondrial. Sin embargo, un Recientemente ha surgido una nueva herramienta importante para la mutagénesis del mtDNA, a saber, la doble hebra Editor de base de citosina derivado de ADN desaminasa (DddA) (DdCBE). Aquí, probamos este emergente herramienta para uso in vivo, mediante la administración de DdCBE en el corazón del ratón utilizando virus adenoasociados (AAV) vectores y muestran que puede instalar las ediciones deseadas de mtDNA en ratones adultos y neonatales. Este trabajo proporciona una prueba de concepto para el uso de DdCBE para mutagenizar mtDNA in vivo en tejidos posmitóticos y proporciona información crucial sobre la traducción potencial a somático humano terapias de corrección de genes para tratar fenotipos de enfermedades mitocondriales primarias.
Las enfermedades mitocondriales son trastornos genéticos causados ​​por mutaciones, ya sea en el nDNA o en el mtDNA, que conducen a un deterioro de la producción de energía mitocondrial y perturbaciones en otros aspectos de la homeostasis celular. Con una prevalencia de ~23 en 100 000, los trastornos mitocondriales se encuentran entre las enfermedades hereditarias más comunes y, a menudo, se asocian con una discapacidad grave y una esperanza de vida más corta 4 . Actualmente no existen tratamientos efectivos para estos trastornos y el manejo clínico se enfoca en el tratamiento de las complicaciones 5 . Las mutaciones en el mtDNA y la disfunción mitocondrial también se han implicado en muchas enfermedades comunes con alto impacto social y envejecimiento 6 , 7 . Las células de mamífero pueden contener de 100 a 1000 copias de mtDNA 8. Las variantes patogénicas en el mtDNA pueden estar presentes en todas las copias (homoplasmia) o solo en una parte de los genomas (heteroplasmia), con una carga mutante que varía entre células, tejidos y órganos 9 . En las células heteroplásmicas, la carga mutante necesaria para la expresión clínica debe superar un umbral, que es muy variable y depende de la variante de mtDNA, los tejidos/órganos afectados y los contextos genéticos/ambientales, pero suele ser superior al 60 % 10 .

A pesar de la revolución en curso de la ingeniería genómica que permiten los sistemas basados ​​en CRISPR/Cas, el mtDNA de los mamíferos ha sido resistente a las modificaciones genéticas, en gran parte debido a la ineficacia de la importación de ácidos nucleicos a las mitocondrias 11 . La incapacidad para editar secuencias de mtDNA en mitocondrias de mamíferos dentro de las células ha obstaculizado la investigación de procesos normales de mtDNA, el desarrollo de modelos in vivo y terapias para enfermedades de mtDNA. Durante muchos años, los enfoques hacia la manipulación del mtDNA en mamíferos se han limitado principalmente a las enzimas de restricción dirigidas mitocondrialmente 12 , 13 , 14 y las nucleasas programables 15 , 16 , 17 , 18 , 19 ., 20 , 21 . Estas nucleasas se han utilizado para eliminar moléculas de mtDNA no deseadas de poblaciones heteroplásmicas, para mover la heteroplasmia de mtDNA mutante por debajo del umbral de patogenicidad 22 . Después de extensos ensayos in vitro, los enfoques basados ​​en nucleasas mitocondriales han alcanzado una prueba de concepto in vivo. Administrado por virus adenoasociados (AAV) en modelos de ratones heteroplásmicos, mtRE, mtZFN, mitoTALEN o mitoARCUS demostraron la eliminación específica del ADNmt mutante en los tejidos diana 23 , 24 , que en algunos modelos y enfoques estuvo acompañada por la eliminación molecular y fisiológica rescate de fenotipos de enfermedad 25 , 26 , 27 .

Si bien las nucleasas programables han demostrado ser útiles para cambiar la heteroplasmia existente, no pueden introducir nuevas variantes de mtDNA. Sin embargo, recientemente ha surgido una herramienta novedosa: el editor de base de citosina derivado de DddA (DdCBE), que cataliza conversiones de C:G a T:A específicas del sitio en mtDNA con buena especificidad de diana en células cultivadas humanas 28 . DdCBE se basa en una toxina bacteriana modificada DddA tox (mitades no tóxicas separadas fusionadas con proteínas TALE) que se dirige a la matriz mitocondrial para catalizar la desaminación de citidinas dentro de dsDNA en la secuencia determinada por el diseño TALE 28 . Los DdCBE actuales desaminan las citidinas (en el contexto de la secuencia TC:GA) a uracilo que conduce a un T C : GA > mutaciones TT:AA tras la replicación posterior 28 . Recientemente también se proporcionó una prueba de concepto inicial de la instalación exitosa de ediciones de mtDNA mediante la entrega de mRNA de DdCBE en embriones en el ratón 29 y el pez cebra 30 .

En este estudio, proporcionamos una prueba de concepto para el uso de DdCBE in vivo en tejido somático. Utilizamos el corazón del ratón como sustituto de un tejido posmitótico y demostramos que el DdCBE administrado mediante AAV puede instalar las mutaciones de ADNmt deseadas en ratones adultos y neonatales. Hasta donde sabemos, tal resultado no se ha informado en la literatura hasta el momento. Este trabajo demuestra que la plataforma DdCBE podría usarse para la mutagénesis de mtDNA específica de tejido in vivo y, potencialmente, para futuras terapias basadas en la corrección de genes mitocondriales somáticos para tratar enfermedades mitocondriales ligadas a mtDNA.

Resultados

Diseño de edición de DdCBE y mtDNA en células cultivadas de ratón

Con la intención de probar la tecnología DdCBE de edición de mtDNA emergente, comenzamos a inducir mutaciones de novo en el complejo I mitocondrial de ratón en células cultivadas y en tejidos somáticos tras la administración de AAV. Nuestro objetivo fue editar el codón GGA de glicina 40 en MT-Nd3 de ratón (posiciones de mtDNA: m.9576 G y m.9577 G) apuntando a los residuos de citosina complementarios con DdCBE (Fig.  1a , C 12 C 13 ). Para permitir esto, diseñamos cuatro pares de DdCBE, que contienen dominios TALE que unen las cadenas ligera (L) y pesada (H) del ADNmt (posiciones mtDNA m.9549–m.9564 y m.9584–m.9599, respectivamente) y diferentes combinaciones de divisiones tox DddA (G1333 o G1397), dirigidas a una secuencia de 19 pb de longitud en el ratón MT-Nd3(posiciones de ADNmt: m.9565–m.9583) (Fig.  1a-b ) y los denominó DdCBE-Nd3-9577-1 a 4. El estudio anterior ha demostrado que para los sitios que contienen dos citosinas consecutivas (precedidas por una timina), ambas citosinas pueden ser editadas por DdCBE, con las siguientes consecuencias potenciales T C C:G G A > T T C:G A A, TC C : G GA > TC T : A GA, T CC : GG A > T TT : AA A (editado C subrayado) 28 . De acuerdo con esto, predijimos tres posibles resultados de la edición de m.9576 G y m.9577 G (Fig.  1b): [i] la desaminación de ambas citosinas complementarias (Fig.  1b , C 12 y C 13 ), daría como resultado una mutación de glicina a lisina (G40K), [ii] la desaminación de C 13 conduciría a una mutación de glicina a ácido glutámico ( G40E), mientras que [iii] la edición exclusiva de C 12 conduciría a un codón de parada AGA prematuro (G40*), según el código genético mitocondrial (Fig.  1b ). Las tres mutaciones predichas están ubicadas en el bucle ND3 conservado, involucrado en la transición de estado activo/inactivo del complejo I (Fig.  1c-d ) 31 , 32 .
[Figura 1]

Consulta la publicación completa en 
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28358-w

 

AEPMI y El Centro Andaluz de Biología del Desarrollo de la Universidad Pablo de Olavide firman un convenio con la Fundación FEDER para la Investigación.

El proyecto apoyado por AEPMI :
“Establecimiento de un modelo animal de deficiencia en COQ6 y estudio de la efectividad del tratamiento con ácido vanílico” ha sido uno de los ganadores y podrá desarrollarse durante los próximos años gracias a la convocatoria de ayudas a la investigación de Fundación FEDER. El centro recibirá 10.000€ para llevar a cabo el proyecto.

• Investigador Principal: Gloria Brea Calvo
• Centro: Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide
• Asociación de enfermos de patologías mitocondriales

Información publicada en la web de FEDER
https://enfermedades-raras.org/index.php/convocatorias-de-investigaci%C3%B3n/16057-resoluci%C3%B3n-vi-convocatoria-de-ayudas-a-la-investigaci%C3%B3n-en-enfermedades-raras-de-la-fundaci%C3%B3n-feder?fbclid=IwAR2AHEtRVMnLf3BySolxS1265AHZoJTou-zf58872iTVRiN6WWNoCuoOdaI

Más información sobre el proyecto:

Establecimiento de un modelo animal de deficiencia en COQ6 y estudio de la efectividad del tratamiento con ácido vanílico.